Каталог книг

Д. В. Ребриков ПЦР в реальном времени

Перейти в магазин

Сравнить цены

Описание

Рассмотрены различные варианты и особенности оборудования для проведения ПЦР «в реальном времени», даны рекомендации по выбору амплификатора. Разобраны особенности систем флуоресцентной регистрации накопления ДНК. Рассмотрены ключевые факторы, определяющие выбор последовательности олигонуклеотидов и параметры программ амплификации. Уделено внимание подготовке проб и особенностям анализа получаемых данных, что необходимо для получения наиболее достоверных результатов. Отдельные главы посвящены применению ПЦР «в реальном времени» для решения различных задач: определения уровня представленности транскриптов, вирусной нагрузки, нуклеотидного полиморфизма, относительного содержания нуклеиновых кислот на примере ГМО. Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

Характеристики

  • Форматы

Сравнить Цены

Предложения интернет-магазинов
Ребриков Д. и др. ПЦР в реальном времени Ребриков Д. и др. ПЦР в реальном времени 436 р. chitai-gorod.ru В магазин >>
Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов ПЦР в реальном времени Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов ПЦР в реальном времени 421 р. ozon.ru В магазин >>
Д. В. Ребриков ПЦР в реальном времени Д. В. Ребриков ПЦР в реальном времени 253 р. litres.ru В магазин >>
ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени 551 р. labirint.ru В магазин >>
Ребриков Д., Коростин Д., Шубина Е., Ильинский В. NGS высокопроизводительное секверирование Ребриков Д., Коростин Д., Шубина Е., Ильинский В. NGS высокопроизводительное секверирование 450 р. chitai-gorod.ru В магазин >>
Боровков Ю., Дробатенко В., Ребриков Д. Основы горного дела. Учебник Боровков Ю., Дробатенко В., Ребриков Д. Основы горного дела. Учебник 1362 р. chitai-gorod.ru В магазин >>
Боровков Ю., Дробатенко В., Ребриков Д. Технология добычи полезных ископаемых подземными способами. Учебник Боровков Ю., Дробатенко В., Ребриков Д. Технология добычи полезных ископаемых подземными способами. Учебник 1128 р. chitai-gorod.ru В магазин >>

Статьи, обзоры книги, новости

ПЦР в реальном времени, Ребриков Д

ПЦР в реальном времени, Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., 2009

ПЦР в реальном времени, Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., 2009.

Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количествах.

Предисловие Л.А. Остермана

Предисловие Е.Д. Свердлова

Перечень компаний, упомянутых в тексте

1.1. Изобретение ПЦР

1.2. Изобретение ПЦР «в реальном времени»

1.3. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени»

1.4. Развитие ПЦР «в реальном времени»как диагностического инструмента

Глава 2. Основы полимеразной цепной реакции

2.1. Общие сведения о ПЦР

2.2. Организация НЦР-лаборатории

2.3. Оборудование и материалы для ПЦР

2.4. Свойства олигонуклеотидов (праймеров и проб)

2.5. Влияние ионов Mg2+

2.6. Свободные дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNТРs)

2.8. Минеральное масло

2.9. Другие компоненты, добавление которых влияет на ПЦР

2.10. Ферменты, используемые в ПЦР

2.11. Программы амплификации

2.12. «Горячий старт» (hot start)

Глава 3. Оборудование для ПЦР «в реальном времени»

3.1. Устройство детектирующих амплификаторов

3.2. Основные функциональные узлы

3.3. Обзор характерных разновидностей приборов

3.4. Тенденции развития оборудования для ПЦР «в реальном времени»

Глава 4. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР «в реальном времени»

4.3. Гасители флуоресценции

4.4. Неспецифичные системы детекции

4.5. Специфичные системы детекции

Глава 5. Дизайн праймеров и проб, программы амплификации

5.1. Параметры, влияющие на взаимодействие олигонуклеотида и ДНК

5.2. Выбор последовательности проб

5.3. Программное обеспечение для дизайна праймеров и проб

5.4. Особенности систем праймеры проба

5.5. Особенности программ амплификации для ПЦР «в реальном времени

Глава 6. Особенности очистки нуклеиновых кислот для ПЦР «в реальном времени»

6.1. Общие принципы очистки нуклеиновых кислот для использования в ПЦР

6.2. Особенности взятия биоматериала для клинических ПЦР-исследований и риск контаминации

6.3. Особенности методов очистки НК для ПЦР «в реальном времени»

6.4. Типовые ошибки использования ПЦР «в реальном времени», связанные с количеством нуклеиновых кислот, забираемых в реакцию

Глава 7. Анализ данных ПЦР «в реальном времени»

7.1. Методы и средства анализа графиков накопления ДНК

7.2. Простая модель ПЦР

7.3. Связь флуоресцентного сигнала и накопления ДНК в ходе ПЦР

7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления ДНК (Ct)

7.5. Определение эффективности ПЦР

7.6. Недостатки порогового метода и пути их преодоления

7.7. Методы прямого сравнения графиков накопления ДНК(СР)

7.8. Комбинация методов Ct и Ср

Глава 8. Определение уровня представленности транскриптов

8.1. Организация эксперимента

8.2. Абсолютное определение уровня представленности транскриптов

8.3. Относительное определение уровня представленности транскриптов

8.4. Нормировка данных

8.5. Внутренний контрольный образец

8.6. Отрицательный контрольный образец

Глава 9. Количественное определение вирусной нагрузки

9.1. Количественное определение вирусной нагрузки

9.2. Источники погрешностей и варианты учета потерь и эффективности реакции

Глава 10. Использование ПЦР «в реальном времени» для определения однонуклеотидного полиморфизма

10.1. Однонуклеотидный полиморфизм последовательностей ДНК

10.2. Идентификация ОНИ с помощью аллель-специфичных праймеров

10.3. Дифференциация аллелей с помощью олигонуклеотидных проб

10.4. Генотипирование ОНП методом плавления ДНК-дуплексов

Глава 11. Определение относительного содержания нуклеиновых кислот на примере генетически модифицированных источников

11.1. Общие сведения о ГМИ

11.2. Классификация существующих методов определения ГМИ в продуктах питания

11.3. Организация чужеродной ДНК в геноме растений

11.4. Выбор последовательностей-мишеней для выявления чужеродной ДНК в геноме растения

11.5. Тест-системы для определения процентного содержания чужеродной ДНК относительно геномной ДНК растений

11.6. Выбор чужеродной и нормировочной ДНК для количественного определения ГМИ

11.7. Калибровочные образцы

11.8. Точность метода определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пище с помощью метода ПЦР «в реальном времени»

Бесплатно скачать электронную книгу в удобном формате и читать:

Источник:

nashol.com

ПЦР в реальном времени Электронный ресурс

«ПЦР в реальном времени [Электронный ресурс] / П11 Д. В. Ребриков [и др.] ; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. — 6-е изд. (эл.). — Электрон. текстовые дан. (1 файл pdf : . »

Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов,

П. А. Семёнов, А. М. Савилова, И. А. Кофиади,

Под общей редакцией Д. В. Ребрикова

ПЦР в реальном времени [Электронный ресурс] /

П11 Д. В. Ребриков [и др.] ; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. — 6-е изд. (эл.). — Электрон. текстовые дан.

(1 файл pdf : 226 с.). — М. : БИНОМ. Лаборатория

знаний, 2015. — Систем. требования: Adobe Reader XI ;

ISBN 978-5-9963-2954-0 Рассмотрены различные варианты и особенности оборудования для проведения ПЦР «в реальном времени», даны рекомендации по выбору амплификатора. Разобраны особенности систем флуоресцентной регистрации накопления ДНК. Рассмотрены ключевые факторы, определяющие выбор последовательности олигонуклеотидов и параметры программ амплификации. Уделено внимание подготовке проб и особенностям анализа получаемых данных, что необходимо для получения наиболее достоверных результатов. Отдельные главы посвящены применению ПЦР «в реальном времени»

для решения различных задач: определения уровня представленности транскриптов, вирусной нагрузки, нуклеотидного полиморфизма, относительного содержания нуклеиновых кислот на примере ГМО.

Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических лабораторий, а также для преподавателей и студентов, специализирующихся в области молекулярной биологии.

УДК 577.21 ББК 28.04 Деривативное электронное издание на основе печатного аналога: ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков [и др.] ; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. — 6-е изд. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. — 223 с. : ил. — ISBN 978-5-9963-1898-8.

В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков или выплаты компенсации c БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011 ISBN 978-5-9963-2954-0 ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие Л. А. Остермана. 6 Предисловие Е. Д. Свердлова. 7 Список сокращений. 8 Перечень компаний, упомянутых в тексте. 9 Глава 1. Что такое ПЦР.

Развитие большинства современных научных дисциплин напрямую связано с развитием применяемых исследователями методов. В последние десятилетия именно новые методические подходы определяли прорывы в области биохимии и молекулярной генетики. При этом понимание сути используемых методик всегда являлось необходимым условием эффективного экспериментального подхода. Одним из таких методов, позволивших генетикам и молекулярным биологам сделать сразу несколько огромных шагов вперед, безусловно стало изобретение метода полимеразной цепной реакции.

Несмотря на то, что принцип ПЦР понятен большинству школьников после краткого его изложения, этот метод обладает массой нюансов, о существовании которых подозревают далеко не все исследователи, использующие его в повседневной практике. Так, далеко не каждый экспериментатор учитывает влияние эффективности ПЦР на результат амплификации.

А между тем данный параметр определяет возможность сравнения результатов для разных реакций. Другой пример типичного «заблуждения» — отождествление накопления ДНК и накопления флуоресцентного сигнала при проведении ПЦР «в реальном времени», хотя есть масса примеров из практики, когда эти процессы идут независимо.

Предлагаемая читателю книга направлена, в первую очередь, на объяснение тонкостей метода полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов в режиме «реального времени». Авторы постарались рассмотреть все нюансы метода, позволяя читателю разобраться в сути процесса. Работа выстроена по принципу использования метода ПЦР «в реальном времени» для решения различных задач. При этом авторы постарались сделать так, чтобы исследователь мог обратиться к каждой отдельной главе, поняв особенности данного варианта применения метода даже без прочтения всей книги.

Л. А. Остерман ПРЕДИСЛОВИЕ Е. Д. СВЕРДЛОВА

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) «в реальном времени» — методика, прочно вошедшая в повседневную практику исследовательских и клинических лабораторий по всему миру.

Спектр задач, для решения которых применяется ПЦР «в реальном времени», увеличивается с каждым днем. Сюда можно отнести как сферу научных исследований (определение уровня экспрессии генов, анализ количественного соотношения альтернативно сплайсированных форм мРНК и т. д.), так и сферу прикладных применений (определение уровня бактериальной или вирусной нагрузки органа, поиск следов генно-инженерных конструкций в продуктах питания и т. д.).

Несмотря на то, что число обзоров и монографий (A–Z of Quantitative PCR; Real-Time PCR (BIOS Advanced Methods)), посвященных ПЦР «в реальном времени», постоянно растет, ощущается значительная нехватка подобных работ на русском языке. Поэтому книга Д. В. Ребрикова с соавторами, являющаяся первой работой такого уровня, посвященной различным аспектам ПЦР «в реальном времени», вне всякого сомнения, актуальна и с успехом заполнит существующий вакуум соответствующих русскоязычных учебных пособий.

Книга написана коллективом авторов, не просто использующих ПЦР «в реальном времени» в повседневной практике, но являющихся ведущими в нашей стране разработчиками оборудования и реагентов для ПЦР в «реальном времени». Разностороннее и творческое понимание физической и биологической составляющих научной основы метода помогло авторам в полной мере осветить особенности ПЦР «в реальном времени» и дать читателям точную, написанную доступным языком картину процессов, идущих в реакционной пробирке.

По своей структуре и глубине описания этих процессов книга нацелена, в первую очередь, на сотрудников научно-исследовательских лабораторий и студентов, стремящихся разобраться в фундаментальных принципах и нюансах метода.

Вместе с тем, каждая глава содержит много конкретных практических рекомендаций, делая книгу ценной также для практикующих специалистов.

Е. Д. Свердлов Академик РАН и РАСХН, советник РАН

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMV — вирус миелобластоза птиц dNTPs — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты DTT — дитиотрейтол EBV — вирус Эпштейна–Барр FACS — флуоресцентный клеточный сортировщик FLASH — флуоресцентная детекция результатов после ПЦР FRET — флуоресцентно-резонансный перенос энергии GFP — зеленый флуоресцирующий белок HBV — вирус гепатита B HCV — вирус гепатита C HIV — вирус иммунодефицита человека HSV — вирус простого герпеса LCR — лигазная цепная реакция LNA — линейная нуклеиновая кислота MGB — связыватель малой бороздки MMLV — вирус лейкемии мышей Молони NASBA — основанная на последовательности нуклеиновых кислот амплификация pH — водородный показатель Tm — температура «плавления»

TMA — опосредованная температурой амплификация БСА — бычий сывороточный альбумин ВКО — внутренний контрольный образец ГиФА — гибридизационно-ферментный анализ ГМ — генетически модифицированный ГМИ — генетически модифицированный источник ГМО — генетически модифицированный организм ДМСО (DMSO) — диметилсульфоксид ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ЖХВД (HPLC) — жидкостная хроматография высокого давления ИКП — инвертированный концевой повтор кДа — килодальтон кДНК — комплементарная ДНК КПД — коэффициент полезного действия мкМ — микромоль мМ — миллимоль мРНК — матричная РНК НК — нуклеиновая кислота ОЕ — оптическая единица ОНП — однонуклеотидный полиморфизм ОТ — обратная транскрипция ОТ-ПЦР — обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция п. н. — пара нуклеотидов ПААГ (PAGE) — электрофорез в полиакриламидном геле ПЗС — прибор с зарядовой связью ПЦР — полимеразная цепная реакция рекДНК — рекомбинантная ДНК РНК — рибонуклеиновая кислота рРНК — рибосомальная РНК т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов ТЭ — термоэлектронный УФ — ультрафиолет ФЭУ — фотоэлектронный умножитель ЭДТА — этилендиаминтетраацетат

ПЕРЕЧЕНЬ КОМПАНИЙ, УПОМЯНУТЫХ В ТЕКСТЕ

Agilent Teсhnologies Ambion Applied Biosystems Bayer Diagnostics Bio-Rad Cepheid Corbett Research Digene Diagnostics DNASTAR Gen-Probe Inc.

Hasting Software Idaho Molecular Biology Insights Organon Teknika QIAGEN Roche Stratagene НПФ ДНК-Технология ГЛАВА 1

1.1. ИЗОБРЕТЕНИЕ ПЦР В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически в неограниченных количествах.

В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при диагностике рака и иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации личности и определения биологического родства индивидов.

Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для контроля за микробиологическим загрязнением окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). В научноисследовательских лабораториях ПЦР используют для изучения нуклеиновых кислот и проведения манипуляций с ними.

Например, благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК в чистом виде и в достаточном количестве.

Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять данную область науки на качественно новый уровень. Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику.

Основные принципы полимеразной реакции и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году [Kleppe et al, 1971]. Однако исследователями не была продемонстрирована главная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК.

Что такое ПЦР 11

Рис. 1.1. Принцип экспоненциальной амплификации ДНК в ходе ПЦР

В 1983 году сотрудник фирмы «Cetus» Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов.

На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ферментом ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение числа определенных фрагментов ДНК (рис. 1.1).

Следует отметить, что широкому распространению ПЦР сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности фермент ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность после нагревания до 100 °С. Использование программируемых термоциклеров, изменяющих температуру реакционной смеси по заданной циклической программе, и ферментов из термофильных микроорганизмов, существенно упростило проведение реакции, сделав ее рутинной процедурой.

Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 году Saiki с соавт.

опубликовали статью, в которой была описана амплификация участка гена b-глобина [Saiki et al, 1985]. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической проГлава 1 грессии. Метод приобрел такую популярность, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. На основе ПЦР были созданы современные технологии секвенирования (определения последовательности нуклеотидов в ДНК). В настоящее время существует множество модификаций ПЦР, одной из которых и посвящена данная работа.

1.2. ИЗОБРЕТЕНИЕ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

Поскольку в ходе полимеразной цепной реакции происходит наработка определенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто используемым из которых является метод электрофореза молекул ДНК в геле с окрашиванием бромистым этидием. Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации об эффективности процесса (если не использовать специальную постановку эксперимента), снижая тем самым потенциальную информативность ПЦР. Применение метода было ограничено задачами, в которых было достаточно ответа «да»–«нет».

В начале 90-х годов прошлого столетия исследователи предложили регистрировать накопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР [Higuchi et al, 1992]. К этой идее их подтолкнуло желание использовать метод ПЦР для количественного определения исходного числа матриц, попавших в реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР и ранее использовали для количественного определения нуклеиновых кислот, изобретение ПЦР «в реальном времени» существенно упрощало технику измерения и делало подход более точным [Higuchi et al, 1993].

С этого момента началось бурное развитие как приборной, так и реагентной базы для выполнения ПЦР с регистрацией накопления продуктов амплификации непосредственно в ходе реакции (рис. 1.2). Уже в середине 90-х годов появились первые детектирующие амплификаторы (термоциклеры), а к настоящему моменту их разнообразие перевалило за 30 (на рынке присутствует более 10 компаний, промышленно выпускающих приборы данного типа).

Можно с уверенность констатировать быстрое замещение обычной ПЦР методиками с флуоресцентной регистрацией накопления ДНК в области выявления и количественного определения нуклеиновых кислот. В первую очередь это связано с удобством процедуры за счет отсутствия отдельной стадии деЧто такое ПЦР 13

Рис. 1.2. Этапы развития метода ПЦР

текции результатов ПЦР. Кроме того, флуоресцентные методы позволяют избирательно регистрировать амплификацию лишь определенных фрагментов ДНК (за счет использования олигонуклеотидных проб), повышая тем самым достоверность исследования. Вместе с тем, обычная ПЦР сохраняет свои позиции в методиках, требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования (клонирования, определения последовательности и т. п.). Здесь дополнительные компоненты реакции (интеркалирующие красители, пробы) могут помешать последующим процедурам и их лучше исключить из состава реакционной смеси (рис. 1.3).

1.3. ОТЛИЧИЕ АНАЛИЗА ПРОДУКТОВ ПЦР

«ПО КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» И «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении амплификации («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции («в реальном времени»). «Классическая» ПЦР предполагает анализ результатов реакции «по конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентную детекцию после ПЦР (FLASH) и др. Все эти подходы показывают количество продукта реакции в определенный момент течения процесса (обычно — по завершении процесса), давая исследователю лишь статичную картинку динамичного процесса. Электрофореграмму агарозного геля по информативности для исследователя можно сравнить фотографией фигуриста, по которой судьи должны выставить оценки за технику и артистичность всего выступления.

При регистрации накопления продуктов амплификации на протяжении всего процесса, исследователь получает гораздо больше информации об особенностях реакции. Продолжая аналогию, можно сказать, что ПЦР «в реальном времени» — это киносъемка выступления фигуриста. Зная кинетику процесса, можно уже оценивать начальные параметры реакции и сравнивать реакции между собой.

Приведем такой пример: среди исследователей, использующих ПЦР для оценки уровня представленности транскриптов, часто можно встретить суждение, что чем больше продукта реакции видно на электрофореграмме, тем больше матриц было добавлено в реакцию на старте. На рисунке 1.4 приведен результат эксперимента, в котором в параллельные реакции было добавлено одинаковое количество стартовых молекул ДНК. Анализ электрофореграммы показывает, что в реакциях получено разное количество продукта ПЦР. Однако кривые накопления продукта амплификации ярко демонстрируют схожую начальную концентрацию матриц.

1.4. РАЗВИТИЕ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»

КАК ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИНСТРУМЕНТА

Переход любого метода из научно-исследовательской лаборатории в лабораторию диагностическую сопряжен с рядом возникающих на этом пути проблем: уровень специальной подготовки сотрудников диагностической лаборатории принциЧто такое ПЦР 15 Рис. 1.4. Пример графиков накопления продуктов амплификации для четырех реакций с одинаковым начальным количеством матричной ДНК. На врезке показана электрофореграмма тех же реакций. Видно, что, несмотря на различие в конечной концентрации продуктов реакции, появление регистрируемого прибором сигнала для всех пробирок произошло одновременно, что свидетельствует о схожести начального количества ДНК пиально отличается от подготовки сотрудников научно-исследовательского института. В медицинской диагностике гораздо выше требования к воспроизводимости получаемых результатов, трактовка результатов исследования должна быть стандартизована и автоматизирована и т. д.

В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР в ближайшем будущем.

1. Повышение общей надежности метода.

2. Дальнейшее упрощение процедуры анализа.

3. Сокращение времени исследования.

4. Широкое внедрение количественной ПЦР.

Эти тенденции будут реализованы за счет использования флуоресцентных методов детекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методов регистрации и трактовки результатов исследования.

Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении ПЦР-диагностики довольно проста. В клинической лабораторной диагностике исследование принято подразделять на три этапа: пробоподготовка (очистка ДНК или РНК исследуемого объекта от примесей), амплификация определенного фрагмента ДНК и регистрация результатов амплификации. Развитие 16 Глава 1 методик пробоподготовки можно прогнозировать в направлении повышения эффективности лизиса и удаления ингибиторов и автоматизации процесса. Некоторые образцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективность реакции.

При проведении количественного ПЦР-анализа отличие в эффективности амплификации может внести существенную ошибку, поэтому с распространением количественного анализа требования к чистоте получаемой ДНК повышаются. Для этапа амплификации стоит отметить тенденцию к переходу от использования отдельных реакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных пробирок (8- или 12-луночные стрипы и 96- или 384-луночные планшеты). При этом возможность использования многоканальных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру приготовления реакционной смеси. Крупные диагностические центры, при использовании планшетных форматов, могут применять роботизированные дозирующие станции, снижающие вероятность ошибки лаборанта.

Достоверность исследования в значительной мере связана со способом детекции и интерпретации результатов ПЦР (см.

табл. 1.1). В настоящее время можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР, наиболее часто применяемых в диагностических лабораториях: гель-электрофорез, гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА), флуоресцентная детекция результатов после ПЦР (FLASH) и флуоресцентная детекция во время ПЦР (ПЦР «в реальном времени»). Последние два метода отличаются тем, что продукт амплификации для определения не извлекается из пробирки, а регистрация результатов (измерение флуоресценции) идет в закрытой пробирке. Тем самым решается одна из ключевых проблем внедрения ПЦР в медицинскую лабораторную практику — проблема контаминации (см. гл. 2).

Применение системы детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце мишени, позволяет оценить его количество, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более адекватный метод лечения.

Современные компьютерные программы в комбинации с применением флуоресцентно-меченных гибридизационных олигонуклеотидных проб для визуализации результатов ПЦР (методы FLASH или ПЦР «в реальном времени») позволяют практически полностью исключить неверную трактовку результатов. Автоматизированная система фиксирования данных Таблица 1.1. Сравнение методов детекции результатов ПЦР

с детектирующего амплификатора или специализированного флуориметра в памяти персонального компьютера позволяет вести эффективную документацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенном анализе в стандартном виде.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P. S., Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. 1992 10:413–417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR:

Real time monitoring of DNA amplification reactions // Biotechnology. 1993 11:1026–1030.

3. Kleppe K., Ohtsuka E., Kleppe R., Molineux I., Khorana H. G. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases // J Mol Biol. 1971 56:341–361.

4. Saiki R. K., Scharf S., Faloona F., Mullis K. B., Horn G. T., Erlich H. A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 1985 230:1350–1354.

[. ] Минимальные системные требования определяются соответствующими требованиями программы Adobe Reader версии не ниже 11-й для платформ Windows, Mac OS, Android, iOS, Windows Phone и BlackBerry; экран 10"

«СТРАТЕГИЧЕСКИЕ РЕШЕНИЯ В СФЕРЕ IT-БЕЗОПАСНОСТИ КИБЕРБЕЗОПАСНОСТЬ КРУПНЫХ ITИНФРАСТРУКТУР Содержание Защита IT-инфраструктуры сегодня — ваш вклад в безопасное завтра Защита и контроль рабочих мест Безопасность мобильных устройств Защита виртуальных сред Защита центров обработки данных. »

«УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 156, кн. 4 Естественные науки 2014 ЛЮДИ НАУКИ ВИКТОР ВИНТЕР: "УЖЕ СЕГОДНЯ МЫ ДОЛЖНЫ СМОТРЕТЬ ДАЛЕКО ВПЕРЁД, ЗА ГОРИЗОНТЫ СОВРЕМЕННОЙ НАУКИ." ПАМЯТИ ВЫДАЮЩЕГОСЯ УЧЁНОГО Ф.К. Алимова, З.И. Абрамова, Н.И. Акберова, Д.А. Темников В этом году исполнилось бы 75 лет со дня. »

«УДК 024 ББК 78.381 А521 Алтай литературный : сборник методических маА521 териалов в помощь работе библиотек по продвижению произведений алтайских писателей / Алт. краев. универс. науч. б-ка им. В. Я. Шишкова, науч.-метод. отд. ; сост. Т. А. Старцева; ред. Т. В. Смелова. – Барнаул : РИО АКУНБ, 2012. – 213 с. В год празд. »

«Васильев Антон Викторович, Самойлова Наиля Камилевна ФОРТЕПИАННОЕ ТРИО: ОСОБЕННОСТИ КЛАССИЧЕСКОГО ЭТАПА В ЭВОЛЮЦИИ ЖАНРА Статья раскрывает некоторые особенности классического этапа в эволюции жанра фортепианного трио. Рассмотрены генетические истоки ж. »

«УДК 004.9 А.Г. Олейник, А.М. Федоров ПРОБЛЕМЫ И ЗАДАЧИ ФОРМИРОВАНИЯ ЕДИНОГО ИНФОРМАЦИОННОГО ПРОСТРАНСТВА АРКТИЧЕСКОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Аннотация В работе дается краткий анализ особенностей формирования и обеспечения надежного функционирования единого информационного пространства в Арктической зоне Российской Фе. »

«Публичное акционерное общество "Ярославский радиозавод" Место нахождения: Российская Федерация, 150010, г. Ярославль, ул. Марголина, д.13 УВАЖАЕМЫЙ АКЦИОНЕР! Совет директоров П. »

«Оглавление Раздел I. Короба кабельные Короб кабельный блочный типа ККБ 1. Короба кабельные типа КП 2. Раздел II. Лотки кабельные Лотки серии ЛП 3. Лотки серии НЛ 4. Лотки серии ЛГ 5. Лотки серии ЛМГ 6. Раздел III. »

«Ключевые рынки. Недельный фокус 11 апреля 2016 ИЗМЕНЕНИЯ НА КЛЮЧЕВЫХ РЫНКАХ За прошедшую неделю цена нефти марки Brent выросла на 8,5% до $41,9/барр. Российская нефть Urals подорожала за неделю на 11,9% и закрылась на $38,9/барр. Курс доллара снизился на 0,7% до 67,15 рублей, а курс евро на 0,5%, закрывши. »

«УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ЦАГИ Том XLIV №5 УДК 629.735.45.015.4 ИССЛЕДОВАНИЕ ПОСАДОЧНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ВЕРТОЛЕТА НА ПОЛОЗКОВОМ ШАССИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ЛЕТНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА С. А. АЛИМОВ, С. А. МИХАЙЛОВ, Д. В. НЕДЕЛЬКО, С. В. САЛТЫКОВ, А. А. УСОЛЬЦЕВ Авторами выполнен анализ результато. »

Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.

Источник:

net.knigi-x.ru

Д. В. Ребриков ПЦР в реальном времени в городе Волгоград

В этом интернет каталоге вы можете найти Д. В. Ребриков ПЦР в реальном времени по разумной цене, сравнить цены, а также найти прочие предложения в группе товаров Детская литература. Ознакомиться с характеристиками, ценами и рецензиями товара. Транспортировка производится в любой населённый пункт России, например: Волгоград, Ростов-на-Дону, Омск.